Il test leucocito-tossico

Come si esegue il test leuco-citotossico

Questo test si basa sull’analisi della reazione dei leucociti una volta posti a contatto con gli estratti alimentari nei confronti dei quali si vuole stabilire l’intolleranza. L’analisi viene effettuata direttamente sulle cellule leucocitarie mediante un microscopio ottico in campo oscuro.

La metodica seguita per l’esecuzione del test è quella proposta da Bryan e consta delle seguenti fasi:

• 5 ml di sangue si raccolgono in provetta con anticoagulante (citrato di sodio 3,8 g/L) e si centrifugano a 2000 - 3000 x g per 3’ minuti. Si formano così due fasi: la parte inferiore, contenente i globuli rossi e la parte superiore, contenete il plasma. All’ interfaccia è presente l’ anello leucocitario (buffy coat) sotto forma di sottile strato biancastro.
• Mediante pipetta Pasteur monouso da 1 mL si procede alla raccolta dell’ anello leucocitario (buffy coat)..
• Il materiale prelevato si trasferisce in una provetta contenente da 1,5 mL a 2,5 di acqua (pH: 7, durezza: 27,5 F°) e si diluisce delicatamente con la pipetta.
• Singole gocce di tale materiale diluito si pongono a contatto con gli estratti alimentari predisposti sui vetrini.
• I vetrini si coprono con gli appositi copri-oggetto ( 24x60 mm) e si lasciano incubare per 10- 15 minuti.
• I vetrini si analizzano ad un microscopio ottico con un ingrandimento finale di 20X e 40X ( il 20X viene utilizzato per una visione globale, mentre il 40X per una visione dettagliata).

Dall’osservazione dei leucociti si attribuisce un diverso grado di reazione nei confronti dell’estratto alimentare secondo la seguente scala:

• livello 0         reazione assente (nessuna alterazione morfologica e strutturale dei leucociti)
• livello 1         reazione lieve (rari danni ai leucociti)
• livello 2         reazione media (leucociti con semplice rigonfiamento cellulare, ma senza lesioni della membrana cellulare)
• livello 3         reazione forte (leucociti con vacuoli e leggere lesione della membrana cellulare)
• livello 4         reazione molto forte (leucociti fortemente danneggiati con membrana cellulare disgregata e apertura cellulare)

Questi livelli di reazione vengono definiti in base allo stato del leucocita, il quale passa da una condizione normale ad una di rigonfiamento, poi di vacuolizzazione ed infine di rottura, oltre che dalla quantità relativa dei leucociti che hanno reagito rispetto al totale.

Prima di procedere con l’analisi delle reazioni di intolleranza ai vari cibi, si analizza il vetrino di controllo sul quale i leucociti sono posti a contatto solamente con i composti usati per l’estrazione degli alimenti.

In questa fase, non solo ci si assicura che le reazioni analizzate successivamente siano specifiche e relative all’alimento, ma si controllano anche la quantità dei globuli bianchi per campo ottico che si andrà ad analizzare (controllo sulla procedura di lavoro), così come lo stato dei globuli bianchi del singolo paziente.

I nostri vetrini sono costruiti sulla base di una lunga ricerca, che ha permesso di ottenere un prodotto ad altissima qualità, in quanto teflonato ed a 6 pozzetti, rendendo possibile una semplicità di lettura, un risparmio di materiale e una precisione studiata.